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胚胎冷冻和冻胚移植

   (一)适应证

    (1)促排卵周期胚胎移植后有剩余胚胎需要保存。

    (2)促排卵周期发生严重的OHSS，为防止妊娠后病情加重，需将胚胎保存至以后移植。

    (3)促排卵周期进行胚胎移植时插管入宫腔失败或非常困难，对子宫刺激较大，不利于着床，应保存胚胎至以后周期再移植。  

(二)技术程序与方法

    胚胎可于双原核期、2～8细胞期或囊胚期进行冻存。其中双原核期与2～8细胞期(合称早期胚胎)冻融程序相同。

    1．早期胚胎冻融方法

    (1)缓慢降温一快速复温法：此法最常用。

    ①冷冻液与解冻液的配制：胚胎冷冻用PROH和蔗糖做冷冻保护剂。溶液现配现用效果较好，配制后需经0．2um针头滤器抽滤。

    冷冻用溶液I(5mg／ml HSA)：．50mg HSA+10ml PBS。

    溶液II(1．5M PROH)：0．5m1PROH+4ml溶液I。

    溶液III(1．5M PROH／0．1M蔗糖)：0．154g蔗糖完全溶解于4m1溶液I中，再加O．5ml PROH。

    复苏用溶液Ⅳ(1.5M PROH／0.2M蔗糖)：0．2805g蔗糖完全溶解于3．65ml溶液I中，再加0．45ml PROH。

    溶液V(O．2M蔗糖)：O．561g蔗糖完全溶解于8．2ml溶液I中。

    溶液Ⅵ(1．0M PROH／0．2M蔗糖)：2ml溶液IV+lml溶液V。

    溶液Ⅷ(O．．5M PROH／0．2M蔗糖)：lml溶液Ⅳ+2ml溶液V。

    现在已有商品化的即用型冷冻液复苏液出售，应用方便，但价格较高。

    ②冷冻程序：首先挑选冷冻胚胎。卵裂球规整均匀或略不均匀，无核碎片<50％者可用于冷冻。冷冻液保持室温，处理胚胎前先使程序冷冻仪达到起始温度20℃。将胚胎在溶液I中漂洗数次，转移至溶液II中放置10分钟，此期间用溶液I漂洗冷冻管并做好标志，转移至溶液III后三段法装冷冻管，封管后放人程序冷冻仪启动程序，整个过程不超过20分钟。

    降温程序：一2℃/分钟，从20℃降至一7℃，停留5分钟，植冰，也就是将冷冻管从冷冻室中稍提出，用在液氮中预冷过的镊子夹无胚胎的溶液段，待形成白色冰块即迅速放回)，停留10分钟，一0．3℃／分钟，从一7℃降至一30℃，一lO℃／分钟，从一30℃降至一120℃，投入液氮保存。

③解冻程序：培养液在37℃、5％COz条件下过夜平衡，复苏液平衡至室温，准备好30℃水浴。从液氮中取出冷冻管，空气中40秒，30℃水浴40秒，剪断冷冻管，后接带气柱的TB注射器，将胚胎注入溶液VI，然后依次移入溶液Ⅶ、V，分别停留5分钟。再移人溶液I停留10分钟，使温度缓慢升至37℃，最后移人培养液中置37℃、5％C02条件下培养至移植。复苏后无核碎片<50％、50％以上的卵裂球保持正常的胚胎被认为经历了冻融依然存活，可用于移植。

 需要注意的是，以上程序中的时间应严格掌握，时间上的误差会严重影响冻融效果。

    (2)超速冻融：

采用高浓度的冷冻保护剂(如4．5M的DMSO或PROH)，胚胎在冷冻保护剂中放置2～3分钟后直接投入液氮保存，复苏时从液氮中取出麦管，22℃水浴解冻，室温下在含1．0M蔗糖、5％血清的PBS中放置10分钟，换置培养液中继续培养。本方法不需程序冷冻仪，操作简单，且高浓度的冷冻保护剂在超速降温时不形成冰晶，但成功率较低。

    (3)玻璃化法：采用多种冷冻保护剂配制成高浓度的玻璃化冷冻液，由于其在降温时通过粘度极度增加，形成无结构的玻璃状态，不形成细胞内结晶，所以不需充分脱水，跨膜浓度与渗透压差不大，不易产生不可逆的细胞膜损伤而引起细胞死亡，且冻融过程采用超速降温与快速复温，操作简便，理论上讲可以克服慢速冷冻的缺陷；但高浓度的冷冻保护剂对胚胎的毒性与致畸性增加，使冻融胚胎成功率不理想，阻碍了玻璃化法的应用，所以如何选择配制合适的冷冻液是其研究的重点。

2．囊胚冻融方法

采用慢冻一快融法。

    (1)冷冻、解冻用溶液：以甘油与蔗糖作为冷冻保护剂。现用现配，配制后0．2um针头滤器抽滤。现在已有商品化冷冻液与解冻液出售。

    冷冻用溶液l(5mg／ml HSA)：50mg HSA+10ml PBS。

    溶液2(5％甘油)：0．2ml甘油+3．8ml溶液1。

    溶液3(9％甘油／0．2M蔗糖)：0．2738g蔗糖完全溶解于3．64ml溶液l中，再加0．36ml甘油。

    解冻用溶液A(10％甘油)：0．4ml甘油+3．6ml溶液l。

    溶液B(0．8M蔗糖)：1．0954g蔗糖完全溶解于4ml溶液l中。

(2)冷冻程序：准备程序冷冻仪至起始温度20℃。冷冻液保持室温。将囊胚在溶液1．中漂洗后转移至溶液2中停留10分钟，停留期间用溶液1漂洗冷冻管并做标志，再转移至溶液3中停留10分钟后，迅速采用三段法装冷冻管送入冷冻仪。降温程序为：一l℃／分钟，从20℃降至一6℃，停留30秒，植冰，停留10分钟，一0．3℃／分钟，从一6℃降至一37℃，一30℃／分钟，再从一37℃降至一120℃，投入液氮保存。

    (3)解冻程序：准备好解冻液、囊胚培养液与30℃水浴。从液氮中取出冷冻管，空气中40秒，30℃水浴40秒，剪断冷冻管，后接带气柱的TB注射器，将胚胎注入溶液4，停留5分钟，然后依次移入溶液5、6、7、8、9，分别停留6、7、7、6、2分钟，溶液保持室温。再移入溶液10停留10分钟，使温度缓慢升至37℃，最后移入培养液置37℃、5％C02条件下培养至移植。-

3．冻胚移植

冻胚移植共有三种周期准备方法：自然周期、促排周期与人工周期，根据患者病情不同进行选择，前两种方法成功率较高。

    (1)自然周期法：用于月经周期规律，有自然排卵的患者。于预计排卵前5天开始阴道B超监测卵泡发育情况。当主导卵泡直径达1．4cm时，开始每8小时测1次尿LH以监测LH峰值,于卵泡直径达1．8cm，LH峰值前肌注HCG

10000Iu，然后监测排卵(亦可不用HCG)。排卵后36小时移植2～5细胞冻胚，60小时移植6～8细胞冻胚，108小时移植冻囊胚。若无卵则根据HCG注射时间为基准，注射后72小时移植2～5个细胞冻胚，96小时移植6～8细胞冻胚，144小时移植冻囊胚。胚胎需解冻后培养2小时以上移植，亦可移植前一天解冻培养过夜，以观察融胚的继续发育情况。

    (2)促排周期法：用于月经周期不规律或无排卵患者。常用CC／HCG方案，目的是为了有1～2个卵泡发育成熟，当卵泡直径达2．0cm或尿LH峰值出现时，注射HCG以模拟自然周期。以排卵时间或HCG注射时间作为基准计算移植时间，算法同自然周期。亦可用HMG／HCG促排，但需小剂量用药以防卵泡发育过多。

    (3)人工周期法：用于闭经、月经不规律、无排卵且对CC及小剂量HMG无反应的患者。于月经第1天开始每天口服补佳乐4～6mg，10天后开始监测内膜发育，当子宫内膜厚度达10mm时，当日肌注黄体酮60mg，次日起改成每天80mg，直至诊断有妊娠为止。注射黄体酮3～4天后移植冻胚，移植时间掌握在周期14～16天。

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