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胚胎植入前遗传学诊断 |
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胚胎植入前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis, PGD)是指运用分子生物学的方法在胚胎植入前的阶段进行遗传学诊断,选择不带有所检测的目标致病基因的胚胎进行移植以建立正常妊娠的技术。通常是从体外受精后6~10细胞阶段的胚胎活检1~2个细胞进行遗传学分析,从而防止遗传病患儿的妊娠。 (一)适应症 1.单基因遗传病:常染色体隐性遗传病:如β-地中海贫血、纤维囊性变常染色体显性遗传病:如α-地中海贫血X-染色体伴性遗传病:如血友病; 2.联体重复序列异常如:如脆性X染色体综合症; 3.色体数目和结构异常:非整倍体、平衡易位、罗伯逊易位; (二)PGD技术过程或注意事项 1.同体外受精与胚胎移植; 2.种植前人类胚胎活检 (1)胚胎活检时机:卵裂期胚胎活检是目前较为切实可行的方法。本中心选择授精后64h进行活检,此时大多数胚胎已发育到6~8细胞期,12小时后待PGD获得结果,再选择胚胎进行移植治疗。 (2)胚胎活检方法:用Hepes缓冲液(以下简称 Hepes)25ul在Falcon 1006皿上作液滴数个,再将Tyrode’s酸液(pH2.4)10 ul放在Hepes液滴旁,上盖矿物油。进行卵裂期胎活检时,将受精后48~72小时的胚胎加入Hepes液滴中,用固定针通过负压将胚胎固定,用吸有Tyrode’s液的喷酸针靠近透明带将其烧灼形成一大小为30~50um的孔,然后再换用吸样本针伸入透明带缺口,吸出一个或多个卵裂球。完成活检后,即将胚胎从固定针上放开,立即将胚胎从Hepes液中捡出,冲洗后放入培养液中继续培养。吸出的卵裂球则放入Eppendorf管中或移在载玻片上,依次逐个完成各个胚胎的活检。 (3)胚胎活检注意事项:人胚体外生长需要稳定的培养环境。任何加于胚胎的操作必然引起其所处的环境波动,而且活检更是一种创伤性操作,包括溶解透明带时喷出的Tyrode’s液所产生的不良影响。人胚发育阻滞易发生于8细胞期,而活检正在这时或稍前进行,此时的胚胎对显微操作的创伤更为敏感,所以活检可以影响胚胎的发育和种植,表现在发育停止,即使生存,其发育也可能延迟或不良,移植后则易错过内膜的种植窗,而且细胞团的细胞数也有所减少,胚胎质量下降,不易种植。为尽量减少甚至避免活检造成的不良影响,应注意:①将需活检操作的胚胎置Hepes缓冲培养液中,它在无需CO2平衡条件下,能保持稳定的PH值与渗透压。②喷酸针内径应在10um左右为宜,太大喷出Tyrode酸量大,烧去透明带太迅猛,以致无法控制殃及卵裂球,甚至改变胚胎所处环境的PH值。太细,喷出的酸量太少不足以溶解透明带。③溶解透明带形成的孔大小约为所吸卵裂球的2/3,太小,不易将卵裂球吸出,或卵裂球局部受力易于破裂,太大,可能吸上两个卵裂球,甚至由于卵裂球间细胞连接的形成而将全部卵裂球吸出,且喷出过多的酸影响卵裂球的发育或透明带缺口太大,失去其保护作用。④当透明带溶解达所需的深度及径线后,立即停止喷酸,同时将胚胎移动离开喷酸区域,不须再将Tyrode酸回吸进去,因此一根喷酸针可用于一批胚胎的活检,不需反复更换,则节省了整个操作时间。⑤每一胚胎在培养箱外的时间应该尽量缩短,所以活检后立即放回然后再取出第二个进行活检。⑥活检的培养液应不含Ca2+,Mg,以减少卵裂球间之细胞连接的形成,有利于活检的顺利完成。若培养液含有Ca++,Mg++,常遇到卵裂球间细胞连接紧密,拉拉扯扯多次才能将一个卵裂球吸出,因而需有耐心。 3.种植前单细胞诊断技术:诊断的技术主要包括PCR和荧光原位杂交(fluorescent in situ hybridization,FISH)及其由PCR和荧光原位杂交衍生的一系列技术。PCR技术主要用于单基因疾病的诊断,而荧光原位杂交技术主要用于染色体疾病的诊断。PCR和荧光原位杂交均可用于性连锁疾病的性别鉴定。单细胞PCR的主要问题在于单个拷贝的扩增可能导致扩增失败以及PCR的高度敏感致污染的可能,而荧光原位杂交能进行特异染色体的检测,实验整个过程可从形态上观察,在进行性别鉴定时有其优势,但也容易受杂交失败或信号过弱的影响。对于染色体核型为45XO的胚胎细胞来说,无论是PCR还是荧光原位杂交都无法做出诊断。因此,在进行临床PGD时分别地分离两个细胞进行诊断较分离一个细胞为好。 |
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